Projekt APVV – 20-0056 PANCO

Vytvorenie systému skorej a rýchlej detekcie, identifikácie a diagnostiky nových infekčných ochorení s pandemickým potenciálom – pilotná štúdia COVID-19

Ciele projektu

Hlavný cieľ projektu

 

  • Cieľom projektu je vytvorenie (univerzálneho) systému skorej a rýchlej detekcie, identifikácie a diagnostiky nových infekčných ochorení s pandemickým potenciálom, v pilotnej fáze realizovanom v priamej súvislosti s aktuálnou pandémiou COVID-19.
  • Systém bude pozostávať z viacerých relatívne nezávislých komponentov, ktorých výskum a vývoj budú predpokladom úspešného naplnenia tohto cieľa. Jednotlivé komponenty sú vybraté a zostavené do systému tak, aby sa reálnosť dosiahnutia komplexného cieľa maximalizovala a v rámci projektu budú v pilotnej fáze čiastkové ciele asociované priamo s týmito komponentami

Žiadateľ

MEDIREX GROUP ACADEMY n.o. (MGA) je organizácia primárne venujúca sa vedecko-výskumným aktivitám, pričom s ohľadom na zameranie materskej spoločnosti Medirex a.s. je v jej špecifickom záujme realizovať predovšetkým aplikovaný výskum v oblasti laboratórnej medicíny.  Za týmto účelom sú v MGA vytvorené čo najlepšie pracovné podmienky reprezentované špecializovanými laboratórnymi priestormi disponujúcimi špičkovým prístrojovým vybavením. V nadväznosti na predchádzajúce výskumné aktivity sú aktuálne jej laboratóriá vybavené špecificky pre histopatologické, molekulárno-genetické a proteomické analýzy. MGA v kontexte svojej krátkej histórie spolupracuje s renomovanými zahraničnými pracoviskami, medzi ktoré patria Karlova Univezita v Prahe (ČR), Univerzita v Heidelbergu (DE). Z pohľadu laboratórnej infraštruktúry a zvládnutých metód využiteľných v rámci predkladaného projektu MGA disponuje komplexným portfóliom umožňujúcich aktívne a plne kompetentne zastrešiť všetky komponenty súvisiace s molekulárno-genetickými analýzami (extrakcia nukleových kyselín, multiplexný RT-qPCR detekčný kit, automatizácia procesov pre vysokopriepustné analýzy, metagenomické sekvenovanie) a všetky s tým súvisiace laboratórne práce. Jej projektový tím pracovníkov vedený popredným a medzinárodne uznávaným odborníkom v oblasti molekulárnej genomiky s aplikáciami v medicínskej oblasti je zložený z profesionálne výborne vybavených jednotlivcov, ktorí majú bohaté skúsenosti s riešením obdobných pracovných úloh a projektov. Zároveň blízka spolupráca MGA s materskou spoločnosťou Medirex zabezpečuje rýchly prenos poznatkov a výsledkov z výskumných úloh do rutinnej klinickej diagnostickej praxe, ktorá je z pohľadu riešeného projektu veľmi žiaduca. V tejto súvislosti je potrebné si uvedomiť aj to, že táto vzájomná blízka spolupráca umožňuje aby vrámci projektu boli pre výskum dostupné reálne klinické vzorky, ktoré budú vo forme použitej biobanky jedným z najdôležitejších predpokladov získania relevantných výsledkov a následne validácií potrebné pre potenciálnu certifikáciu postupov, protokolov a reagenčných kitov.

Míľniky

  1. optimalizácia procesov a vytvorenie štandardných postupov spojených s primárnym spracovaním klinických vzoriek (optimalizácia odberu vzoriek a extrakcie nukleových kyselín);

 

2. dizajn a validácia reagenčného kitu založeného na multiplexnej RT-qPCR na cielenú identifikáciu SARS-CoV-2 vírusových sekvencií vo vzorke spolu s cielenou analýzou iných typov infekčných agensov spôsobujúcich ochorenia s podobnými klinickými prejavmi ako je to v prípade ochorenia COVID-19 (molekulárna diagnostika SARS-CoV-2, iných respiračné ochorenia spôsobujúcich infekčných ochorení) s ambíciou certifikácie kitu pre in vitro diagnostické použitie (CE IVD);

 

3. príprava rekombinantných enzýmov na izoláciu RNA a techniku RT-qPCR  (proteináza K, reverzná transkriptáza, DNA polymeráza). Na produkciu bude využitý expresný systém Escherichia coli, prípadne Pichia pastoris. Okrem samotnej fermentačnej produkcie bude optimalizovaná aj izolácia a purifikácia enzýmov, ako aj optimalizácia dlhodobého uskladnenia enzýmov. Ambíciou je dosiahnutie prakticky neobmedzenej dostupnosti týchto komponentov z domácich (národných) zdrojov pre prípad ich nedostupnosti na bežnej (medzinárodnej) komerčnej úrovni;

 

4. zavedenie a optimalizácia protokolu metagenomického sekvenovania pre detekciu a identifikáciu infekčných agensov z klinických vzoriek na základe informácií z celosvetovo dostupných databáz umožňujúcich odhalenie aj nových dovtedy nepopísaných infekčných agensov;

 

5. spätná zaslepená validácia vybraných klinických vzoriek pozitívnych pri RT-qPCR analýzach na sledované infekčné agensy prostredníctvom referenčnej metódy metagenomického sekvenovania (masívneho paralelného sekvenovania, MPS) s využitím tzv. hypothesis free de novo protokolu vytvoreného v rámci projektu;

 

6. automatizácia procesov spracovania vzoriek na všetkých úrovniach pre zabezpečenie možnosti realizácie analýz vo vysokopriepustnom móde aplikovateľnom pre potreby diagnostiky na populačnej úrovni.

Prínosy projektu

Medzi originálne a inovatívne plánované prínosy projektu budú patriť:

– univerálne know-how umožňujúce detekciu a identifikáciu infekčných agensov (aj nových) založené metodicky na metagenomickom sekvenovaní klinických vzoriek (dostupné aj vo forme novej služby);

– univerzálne know-how umožňujúce dizajn diagnostických súprav určených pre cielenú detekciu infekčných agensov na základe analýzy nukleových kyselín z klinických vzoriek (dostupné aj vo forme novej služby);

– vlastný a prakticky neobmedzený zdroj kľúčových enzýmov potrebných pre na externých zdrojoch nezávislú prípravu diagnostických súprav (dostupné aj vo forme novej služby a produktov);

– nová diagnostická súprava na detekciu SARS-CoV-2 infekcie s možnosťou priamočiarej diferenciálnej diagnostiky klinických vzoriek s klinickými príznakmi podobnými COVID-19 (nový produkt).

Pracovné balíky

  • PB1 – Príprava a zostavenie vzoriek do súborov použiteľných pri zavádzaní, optimalizácii, štandardizácii a validácii jednotlivých komponentov systému – 10/2020 – 09/2021
    Pre rôzne komponenty budú pripravené najskôr rôzne súbory vzoriek, podobne to bude aj s ohľadom na ich použitie v rôznych fázach riešenia projektu, kedy v rámci zavádzania, optimalizácie a štandardizácie procesov bude možné vo veľkej miere používať arteficiálne experimentálne vzorky pripravené zmiešaním „negatívnych“ klinických vzoriek a definovaných (kvalitatívne aj kvantitatívne) kontrolných cieľových molekúl (RNA/DNA kontrolami) formou tzv. spike-in, čo umožní stanoviť aj detekčné  limity (limit of detection – LOD) jednotlivých komponentov, ich kombinácie alebo na úrovni celého systému. Pri následnej validácii jednotlivých komponentov sa budú súbory zostavovať zo vzoriek predtým vyhodnotených ako „pozitívne“ a na ich podklade realizovať validáciu tak, aby bolo možné ju použiť pri následnej certifikácii ako jednotlivých komponentov (stanovenie senzitivity a špecificity testu).

 

  • PB2 – Príprava rekombinantných enzýmov – 09/2020 – 12/2021
    Cieľom tohto balíka bude selekcia génov metódami genome mining (expresiou syntetických génov) a fermentačná príprava a izolácia enzýmov. Enzýmy (proteináza K, reverzná transkriptáza, DNA polymeráza) budú pripravené buď prokaryotickými, alebo eukaryotickými hostiteľmi a budú optimalizované pre produkciu v bioreaktoroch.

 

  • PB3 – Dizajn, výber, optimalizácia a štandardizácia zloženia, procesov, postupov a protokolov jednotlivých komponentov systému – 10/2020 – 06/2021
    Každý z vyššie spomenutých komponentov si vyžaduje použitie odlišného metodického prístup. Navzájom však v rámci pilotného projektu a jeho retrospektívnej podstate nekolidujú a ani dodržanie ich konkrétnej nadväznosti nie je nevyhnutným predpokladom realizácie ich výskumu v tomto PB. Preto bude ich výskum bežať paralelne, čo umožní minimalizovať časové obdobie potrebné na dosiahnutie plánovaných čiastkových cieľov projektu.

 

  • PB4 – Validácia komponentov, ich kombinácií resp. systému a ich certifikácia – 03/2021 – 12/2021
    Pre rôzne komponenty je vyžadovaný odlišný postup validácie, na to viazané experimenty, ktoré umožnia vo výsledku určenie ich presných technických špecifikácií potrebných pre úspešné ukončenie validácie a ich následnú potenciálnu certifikáciu ako nových služieb resp. nových laboratórnych pomôcok (napr. extrakčný protokol a multiplexný RT-qPCR diagnostický kit, biosyntetizované kľúčové enzýmy, databáza sekvencií a nástroj na analýzu metagenomických dát)

 

  • P54 – Testovanie funkčnosti komponentov, ich kombinácie a celého systému v prospektívnom nastavení – 06/2021 – 12/2021
    V záverečnej fáze riešenia projektu bude celý systém prestavený tak aby pracoval v prospektívnom nastavení a bude testovaný s použitím arteficiálne pripravených vzoriek mimikujúcich klinické vzorky so známymi aj novými neznámymi potenciálne infekčnými agensami, pripravený zmiešaním „negatívnych“ aj „pozitívnych“ klinických vzoriek so pridaním umelo vytvorených a syntetizovaných oligonukleotidov s definovanými odlišnosťami od známych virálnych druhov a kmeňov. V rámci tejto fázy testovania budú v definovanej následnosti testované ako jednotlivé komponenty, tak ich kombinácie a aj celý systém, pričom následnosť ich prospektívneho použitia bude extrakcia nukleových kyselín – metagenomická analýza – dizajn multiplexného diagnostického protokolu a cielená analýza vzoriek so stanovením LOD pre „novoidentifikované“ potenciálne infekčné agensy.

Partneri

Slovenská technická univerzita v Bratislave – Fakulta chemickej apotravinárskej technológie

Kontaktná osoba: doc. Ing. Martin Rebroš, PhD.
Tel.: +421 2 59 325 480
e-mail: martin.rebros@stuba.sk
www: www.fchpt.stuba.sk

Ústav biotechnológie, ktorého súčasťou sú aj Laboratóriá aplikovanej biokatalýzy pod vedením doc. Rebroša, patrí medzi popredné dynamicky sa rozvíjajúce pracoviská v rámci Fakulty chemickej a potravinárskej technológie STU. Riešiteľský kolektív dlhodobo spolupracuje s výskumnými organizáciami ako doma, tak aj v zahraničí (University of Manchester (GB); ULC (GB); Queens Universty Belfast (GB); University of Crete (Greece); DTU (DK), Ruhr-Universität Bochum (DE); TU Graz (AT); Akademie věd (ČR) vrámci výskumných projektov. Na pracovisku sa rutinne realizuje na experimentálnej aj rutinnej produkčnej úrovni výskum rekombinantných DNA pre využitie v procesoch biosyntézy (fermentáciou ako v prokaryotických tak eukaryotických expresných systémoch). Na pracovisku budú preto realizovať optimalizácie expresie jednotlivých génov pre enzýmy (proteináza K, reverzná transkriptáza, DNA polymeráza). Experimentálne bude fermentácia prebiehať v rekombinantných mikroorganizmoch bude uskutočnená na baničkách a neskôr v laboratórnych bioreaktoroch. Fermentácie budú prebiehať vo vsádzkovom režime a neskôr budú kombinované s prítokovým systémom a optimalizovanou metodikou na kultivácie s vysokými bunkovými hustotami, čo zabezpečí dostatočné množstvo produkovaných rekombinantných enzýmov s minimalizovanými zariadeniami. V rámci fermentačných procesov je pracovisko schopné porovnávať získané výťažky biomasy, zisťovať špecifickú aktivitu produkovaných enzýmov a celkovú produktivita procesu. Samostatnú časť bude tvoriť optimalizácia indukcie a expresie pre jednotlivé enzýmy. Jedným z možných nežiadúcich efektov pri príprave rekombinantných enzýmov môže byť aj vznik inklúznych teliesok (v prípade E.coli). Tento problém sa bude riešiť zmenou kultivačných podmienok – testovaním rôznej koncentrácie induktora, či fúziou s maltóza-viažucim proteínom, prípadne proteínovým „refoldingom“ po ukončení produkcie a izolácií žiadaného produktu. Pracovisko je zabezpečiť testovanie aktivity enzýmov, ich purifikáciu chromatickými postupmi s implementáciou mikro- a ultra-flitrácie. V rámci výskumu je obdobne pracovisko schopné testovanie vhodnosti rekombinantného producenta, ktorými by v danom projekte budú rôzne kmene E. coli a P. pastoris, a zároveň optimalizovať produkčné podmienky každého mikroorganizmu pre daný enzým separátne.

Publicita

Tento projekt je podporený Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe Zmluvy č. PP-COVID-20-0056.“ V prípade zverejnenia v anglickom jazyku bude znenie „This project is supported by the Slovak Research and Development Agency under the Contract no. PP-COVID-20-0056.“

 

Pri výsledku projektu:

Všetky zverejnenia výsledkov Projektu musia obsahovať poznámku s nasledovným znením:
Táto práca bola podporená Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe Zmluvy č. PP-COVID-20-0056.“ V prípade zverejnenia v anglickom jazyku bude znenie „This work was supported by the Slovak Research and Development Agency under the Contract no. PP-COVID-20-0056.“

Príjemca je oprávnený označiť pracovisko, na ktorom sa Projekt rieši, logom poskytovateľa a písomným oznamom v tomto znení: „Na tomto pracovisku sa rieši Projekt podporený Agentúrou na podporu výskumu a vývoja.“

 

 

Článok bol realizovaný vďaka Agentúre na podporu výskumu a vývoja na základe. 

Zoznámte sa so SARS-CoV-2: novým členom ľudských koronavírusov, RNDr. Michaela Hýblová, PhD., RNDr. Gabriel Minárik, PhD., labMED; Veda a výskum, 2020; 19: 37-40

Info o projekte

Názov projektu:
Vytvorenie systému skorej a rýchlej detekcie, identifikácie a diagnostiky nových infekčných ochorení s pandemickým potenciálom – pilotná štúdia COVID-19

Kód projektu:
PP-COVID-20-0056

Kód výzvy:
PP-COVID 2020

Program:
Podpora výskumu a vývoja so zameraním na zvládnutie pandémie koronavírusu a jej dopadov na obdobie rokov 2020-2021

Financovaný:
APVV – Agentúra na podporu výskumu a vývoja

Prijímateľ
MEDIREX GROUP ACADEMY n.o.

Sídlo
Jána Bottu 2, 917 01 Trnava

IČO:
37986805

Partner:
Slovenská technická univerzita v Bratislave – Fakulta chemickej a potravinárskej technológie so sídlom Vazovova 5, 81243 Bratislava
IČO: 00 397 687
DIČ: 2020845255

 

Celkové oprávnené výdavky na realizáciu aktivít projektu:
398.808- Eur EUR

Obdobie realizácie projektu:     1
6.9.2020 – 31.12.2021                

Miesto realizácie projektu:
SR/Nitriansky kraj/Nitra
SR/Bratislavský kraj/Bratislava – mestská časť Staré Mesto

Kontakt

Subjekt / prijímateľ pomoci – MEDIREX GROUP ACADEMY n.o.

 

Kontaktná osoba:

Ing.Kristina Slezáková

Tel.č.: +421 908 290 376

Mail: diana.duricova@medirexgroupacademy.sk

Webové sídlo: http://www.medirexgroupacademy.sk/